15.1. Характеристика микробиологических и иммунологических лабораторий

Вся работа с микробами проводится в лабораториях, которые в зависимости от основных задач могут быть научно-исследовательскими, диагностическими или производственными.

В системе органов здравоохранения имеются:

Клинико-диагностические лаборатории общего или специального (биохимическая, бактериологическая, иммунологическая, цитологическая и др.) типов, входящие в состав больниц, поликлиник, диспансеров и других лечебно-профилактических учреждений;

Бактериологические лаборатории Госсанэпиднадзора (ГСН);

Санитарно-бактериологические лаборатории ГСН;

Санитарно-химические лаборатории ГСН;

Центральные (ЦНИЛ), проблемные, отраслевые, учебные лаборатории вузов;

Специализированные лаборатории (особо опасных инфекций и др.).

В настоящее время лаборатории и более крупные лабораторные учреждения (отделы, институты, производственные предприятия), как правило, специализированные и работают с той или иной группой микробов.

С вирусами работают в вирусологических лабораториях, располагающих соответствующим оборудованием и использующих спе- циальные методы исследования. Существуют микологические и протозоологические лаборатории. Специализированный характер

приобретают и бактериологические лаборатории, в которых работа концентрируется на определенных группах бактерий, например риккетсиозные, туберкулезные, лептоспирозные, анаэробные и др. Иммунологические исследования проводятся в иммунологических лабораториях, хотя отдельные виды исследований могут выполняться и в микробиологических лабораториях, например серодиагностика инфекционных болезней.

Лабораторная работа с патогенными микробами проводится в специально оборудованных лабораториях, обеспечивающих режим работы и технику безопасности, исключающих возможность заражения персонала и утечку микробов за пределы лаборатории.

Необходимость четкой регламентации условий работы с микробами, в различной степени опасными для сотрудников ла- бораторий и окружающего населения, обусловила разработку классификации микробов, разбив их на 4 группы по степени их биологической опасности (классификация ВОЗ). В России в соответствии с рекомендациями ВОЗ патогенные микробы также делят на 4 группы: 1-я группа - возбудители особо опасных инфекций; 2-я группа - возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний человека; 3-я группа - возбудители инфекционных болезней, выделяемые в самостоятельные нозологические группы; 4-я группа - условно-патогенные микробы - возбудители оппортунистических инфекций. Нумерация групп микробов, принятая в России, отличается обратным порядком от классификации ВОЗ, где к 1-й группе относятся микробы самой низкой патогенности, а к 4-й группе - особо опасные.

В соответствии с делением микробов на группы по степени биологической опасности лаборатории также делят на категории. По номенклатуре ВОЗ выделяют 3 категории микробиологических лабораторий:

Базовые (основные или общего типа) лаборатории, которые в связи с конкретными особенностями работы могут быть оборудованы различными защитными устройствами;

Режимные (изолированные) лаборатории и лаборатории особого режима (максимально изолированные).

Безопасность работ в лабораториях всех категорий обеспечивается выполнением распорядка и правил работы в лаборатории, выполнением требований к лабораторным помещениям и их оснащению, обеспечением лабораторий соответствующим оборудова-

нием, медицинским наблюдением за состоянием здоровья сотрудников, обучением и тренировкой персонала технике безопасности в лаборатории.

15.2. Оснащение микробиологических и иммунологических лабораторий

Помещения базовой лаборатории должны быть просторными для обеспечения безопасного проведения лабораторной работы. Стены, потолок, пол должны иметь гладкую, легко моющуюся поверхность, непроницаемую для жидкостей, устойчивую к дезинфектантам, обычно используемым в лаборатории. Поверхность рабочих столов должна быть водонепроницаемой, устойчивой к дезинфектантам, кислотам, щелочам, органическим растворителям и умеренному нагреванию. Лабораторная мебель должна быть прочной. Пространство под столами и между мебелью должно быть легкодоступно для уборки. В лаборатории должен находиться автоклав для обеззараживания отходов.

Оборудование базовой лаборатории должно ограничивать или предупреждать контакт микробиолога с инфекционным матери- алом, должно быть изготовлено из прочных материалов, непроницаемых для жидкостей, устойчивых к коррозии. Оборудование должно быть сконструировано и установлено так, чтобы оно легко подвергалось чистке, обеззараживанию и проверке.

Лабораторию оснащают микроскопом, автоклавом, термостатами, сушильными, стерилизационными шкафами, аппаратом для свертывания сыворотки, дистиллятором, центрифугами, лабораторными весами, рН-метром, ФЭК, магнитной мешалкой, моечной ванной.

Рабочие помещения лаборатории должны быть снабжены подводкой холодной и горячей воды, электричеством, вакуумом, кис- лородом, воздухом высокого давления и т.п. В некоторых кабинетах оборудуются боксы и вытяжные шкафы.

В число обязательных помещений входят лаборатории кишечных, капельных инфекций, санитарно-бактериологическая, се- рологическая, а также вспомогательные помещения: средоварка, моечная, стерилизационная (чистая и грязная), регистратура, кладовые, санузел для сотрудников, виварий. В лабораториях с пунктами для обследования на носительство микроорганизмов дополнительно оборудуют приемную, процедурную, туалеты для забора

материала. Располагают помещения таким образом, чтобы грязный и чистый потоки не перекрещивались и не соприкасались.

В отношении помещений режимных лабораторий должны соблюдаться те же требования, которые предусмотрены для базовой лаборатории. Кроме того, лаборатория этого типа должна быть отделена от тех частей здания, где передвижение сотрудников не ограничивается. Устройства для мытья рук должны быть снабжены приспособлениями для открывания воды ножной педалью или локтем. Окна должны быть закрыты и заклеены. Входные двери в лабораторные помещения должны быть самозакрывающимися и запирающимися на замок. Вытяжная вентиляция проектируется так, чтобы наиболее низкое давление создавалось в помещениях самой высокой опасности инфицирования. В этом случае движение воздуха будет происходить из вспомогательных помещений в направлении основного рабочего помещения. Отработанный воздух выбрасывается в окружающую среду только после фильтрации через бактериальные фильтры. При оснащении режимных лабораторий оборудованием руководствуются рекомендациями, разработанными для базовых лабораторий, с тем дополнением, что вся работа с инфекционным материалом в них проводится в защитных боксах. В режиме максимально изолированных лабораторий существует ряд особенностей для обеспечения максимальной биологической безопасности персонала, населения и окружающей среды. Вход в лабораторию и выход из нее осуществляются через санитарный пропускник. При входе обязательно полное переодевание в специальную одежду, при выходе перед переодеванием обязательна целевая санитарная обработка (душ, дезинфектанты) персонала. Для снижения риска попадания инфекционного мате- риала в окружающую среду применяют боксирование. С помощью боксов (настольных, ламинарных) создают физические барьеры для предотвращения возможных контактов работающего персонала с инфекционным материалом.

15.3. Правила работы в микробиологической лаборатории

Основные правила работы в базовой лаборатории включают:

Запрет работ с пипеткой при помощи рта;

Запрет приема пищи, питья, курения, хранения пищи и применения косметических средств в рабочих помещениях;

Поддержание чистоты и порядка;

Дезинфекцию рабочих поверхностей не реже 1 раза в день и после каждого попадания на них заразного материала;

Мытье рук персоналом после работы с заразным материалом, животными, перед уходом из лаборатории;

Проведение всех работ таким образом, чтобы свести к минимуму возможность образования аэрозоля;

Обеззараживание всех инфицированных материалов перед выбросом или повторным использованием.

15.4. Принципы микробиологической диагностики инфекционных болезней

Наиболее важное место в лабораторной диагностике инфекционных болезней занимает специфическая микробиологическая диагностика, которую проводят в бактериологической, вирусологической, иммунологической и других лабораториях. Она состоит из трех этапов: преаналитического, аналитического и постаналитического.

Первым этапом микробиологической диагностики является преаналитический, включющий взятие материала для исследования. Выбор исследуемого материала определяется патогенезом и клинической картиной инфекционного заболевания. Исследуемый материал берут по возможности в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и как можно быстрее доставляют в лабораторию (желательно в течение 1 ч). В некоторых случаях посев материала проводят у постели больного. Иногда допускается непродолжительное хранение материала в регламентированных условиях. Исследуемый материал сопровождается документом, в котором обязательно указываются время взятия, характер материала, его источник и точно определяется цель исследования.

Материалом для исследования в медицинской микробиологии служат различные биологические и патологические жидкости организма (кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, испражнения, рвотные массы, промывные воды и т.п.) и ткань - материал биопсии от живого или аутопсии от трупа. В санитарной микробиологии на исследование берут объекты окружающей среды (воздух, воду, пищевые продукты и т.п.) или смывы с них. При заборе материа-

ла для микробиологического исследования необходимо соблюдать следующие правила:

Материал берут непосредственно из очага инфекции или исследуют соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и т.п.);

Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и его повторения в случае необходимости;

Материал берут по возможности в начальном периоде болезни, так как именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию;

Материал берут до начала антимикробной химиотерапии или через определенный промежуток времени после приема антибактериального препарата, необходимый для его выведения из организма;

Следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектанты, антисептики, антибиотики);

Транспортировку материала в лабораторию следует проводить в максимально короткие сроки, в условиях, исключающих гибель неустойчивых видов микробов, или помещать его в специальные транспортные среды;

При транспортировке должны соблюдаться все правила биологической безопасности;

К материалу прилагают сопроводительный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования (фамилия, имя, отчество больного, номер истории болезни, клинический диагноз и т.д.).

15.5. Методы микробиологической диагностики

Аналитический этап включает микроскопический, культуральный, биологический, серологический и аллергологический методы микробиологической диагностики.

Микроскопический метод заключается в приготовлении препаратов (нативных или окрашенных простыми или сложными методами) из исследуемого материала и их микроскопии с применением различных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная и др.). В бактериологии микроскопический метод получил название бактериоскопического, в вирусологии - вирусоскопического.

Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды, культуры клеток или куриные эмбрионы с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя или возбудителей. В бактериологии культуральный метод получил название бактериологического, в микологии - микологического, в протозоологии - протозоологического, в вирусологии - вирусологического.

Биологический метод (экспериментальный или биопроба) заключается в заражении исследуемым материалом чувствительных лабораторных животных или других биологических объектов (куриные эмбрионы, культуры клеток). Его используют для выделения чистой культуры возбудителя, определения типа токсина, активности антимикробных химиотерапевтических препаратов и т.д.

Серологический метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке крови больного, реже - в обнаружении микробного антигена в исследуемом материале. С этой целью используются иммунные реакции.

Аллергологический метод заключается в выявлении инфекционной аллергии (ГЗТ) на диагностический микробный препараталлерген. С этой целью ставят кожные аллергические пробы с соответствующими аллергенами.

Диагностическая ценность этих методов неравнозначна. Ведущим методом микробиологической диагностики является бак- териологический метод, так как он позволяет выделять и иден- тифицировать микроб-возбудитель, т.е. первопричину болезни. Остальные методы менее информативны, так как они позволяют обнаружить в организме изменения, обусловленные наличием в нем микроба. Второе место по значимости занимает серологический метод, поскольку взаимодействие антигена и антитела характеризуется высокой степенью специфичности. Информативность трех остальных методов невысокая, и они обычно служат дополнением к бактериологическому и серологическому методам. Так, микроскопия исследуемого материала далеко не всегда позволяет увидеть и идентифицировать микробы под микроскопом. Их удается обнаружить только при высокой обсемененности ими материала. Даже обнаружив бактерии под микроскопом, идентифицировать их до вида морфологически нельзя. Как известно, все видовое многообразие бактерий сводится к 4 основным морфологическим формам: кокки, палочки, извитые и ветвящиеся формы. Поэтому по микро-

скопической картине можно весьма ориентировочно отнести увиденные бактерии к крупному таксону, например грамположительным коккам. Только в единичных случаях, когда бактерии имеют уникальную морфологию, микроскопически можно определить их родовую принадлежность. Информативность микроскопического метода грибов и простейших выше, так как грибы и простейшие, являясь эукариотами, имеют более крупные размеры и более характерную морфологию.

Диагностические возможности биологического метода ограничены тем, что к большинству возбудителей антропонозных инфек- ций человека лабораторные животные невосприимчивы, поэтому вызвать у них экспериментальную инфекцию не представляется возможным.

Возможности аллергологического метода ограничены тем, что большинство микробов в организме человека не вызывают ГЗТ.

Поскольку микробиологические исследования являются одним из наиболее дорогих видов лабораторных исследований, перед ми- кробиологом стоит задача постановки достоверного микробиологического диагноза с наименьшей затратой времени, сил и средств. Поэтому для постановки диагноза используют 1-5 методов диагностики, чтобы выбранный набор методов гарантировал правильность ответа.

Особое значение приобретают методы экспресс-диагностики, которые позволяют поставить микробиологический диагноз в течение короткого промежутка времени (от нескольких минут до нескольких часов) с момента доставки исследуемого материала в лабораторию. К числу экспресс-методов относятся РИФ, ИФА, РИА, ПЦР, использование биочипов, хроматография и др. Особенности диагностики анаэробных инфекций изложены в материалах диска.

Наряду с традиционными классическими методами микробиологической диагностики в последние годы все большее значение приобретают молекулярно-биологические методы диагностики (ДНК-зонды, ПЦР, лигазная цепная реакция - ЛЦР, хроматография, электрофорез, иммуноблот, биочипы и др.).

Молекулярно-биологические методы диагностики основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного вида микробов, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР.

Постаналитический этап микробиологической диагностики заключается в клинической интерпретации результатов лабораторных исследований. При этом лечащий врач должен оценить этиологическое значение выделенных от больного микробов, скорректировать на основании данных микробиологического мониторинга проводимую больному эмпирическую антимикробную химиотерапию и др.

15.5.1. Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций

В бактериологии для обнаружения возбудителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.

Достоинствами бактериоскопического метода являются простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологических или тинкториальных особенностей возбудителя и достаточном его содержании в исследуемом материале. Данный метод является ориентировочным.

Основной и самый точный метод диагностики бактериальных инфекций бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на его недостатки: длительность исследования (от 4-5 дней до 2 мес), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительную дороговизну. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды - среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как правило, опре- деляют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества воз- будителей в исследуемом материале.

Биологический метод неэкономичен, негуманен, поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, морских свинок, кроликов, обезьян и других животных.

Диагноз инфекционного заболевания возможно установить также с помощью серологического метода, позволяющего обнаружить либо специфические антитела в сыворотке больного, либо специфические антигены непосредственно в исследуемом материале. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является серьезным недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуются изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что также не позволяет быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что с его помощью нельзя точно идентифицировать возбудителя и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за короткое время поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество, но и классы иммуноглобулинов.

При некоторых заболеваниях серологический метод применяют для выявления специфических антигенов в исследуемом ма- териале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического метода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспрессдиагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.

В качестве вспомогательного при небольшой группе инфекционных заболеваний используют аллергологический метод, по- зволяющий выявить повышенную чувствительность к специфическому антигену (аллергену), которым является возбудитель заболевания.

15.5.2. Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций

В вирусологии методы лабораторной диагностики вирусных инфекций имеют свою специфику, учитывая особенности биологии вирусов. Используются вирусоскопический, вирусологический и серологический методы лабораторной диагностики.

Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще используют электронный микроскоп, реже - люминесцентный. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. Лишь для обнаружения крупных вирусов, используя методы сверхокраски, можно применить световой микроскоп. Кроме того, с помощью светового микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях.

Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении лабораторных животных индикация вирусов производится, как правило, по клинической картине болезни, патолого-анатомическим изменениям ориентировочно и окончательно, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявить вирусы в курином эмбрионе, видимых изменений при вскрытии которого, как правило, не наблюдается. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию (в том числе образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РПГА, РТГА, РН, РСК, ИФА и др.). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного времени (5-7 дней и более), значительных материальных затрат и небезопасен.

Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при температуре 4-8 ?С, а вторую сыворотку берут через 10-14 дней. Сыворотки

исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. Так как многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики.

Ведущим методом лабораторной диагностики вирусных инфекций является вирусологический.

Ускоренная и экспресс-диагностика вирусных болезней производится так же, как при бактериальных инфекциях.

15.5.3. Особенности микробиологической диагностики микозов

Для диагностики грибковых инфекций обычно используют микроскопический метод. Микологический метод заключается в по- севе патологического материала на специальные питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Особенностью данного метода является его продолжительность - несколько недель из-за медленного роста грибов. Обнаружение антител при серологическом исследовании возможно со 2-4-й нед болезни. При некоторых заболеваниях выявляют специфические антигены в исследуемом материале. Аллергологический метод используют редко. Нередко при микозах применяют гистологический метод, заключающийся в обнаружении элементов гриба (споры, конидиальные головки и т.п.) в органах и тканях, пораженных грибами. С этой целью готовят гистологические тонкие или ультратонкие срезы тканей, окрашивают их специальными гистологическими и гистохимическими методами и исследуют с применением световой, а в случае необходимости и электронной микроскопии.

15.5.4. Особенности микробиологической диагностики протозойных инфекций

Микроскопическое исследование патологического материала заключается в приготовлении как нативных препаратов («толстая капля»), так и мазков, окрашенных по методу Романовского- Гимзе, и является основным методом диагностики заболеваний, вызванных простейшими. В некоторых случаях применяют серологический и аллергологический методы диагностики.

15.6. Принципы иммунологической диагностики болезней человека

Иммунодиагностика - раздел иммунологии, изучающий и разрабатывающий методы диагностики инфекционных и неинфекци- онных болезней, связанных с функцией иммунной системы.

Многие инфекционные заболевания в настоящее время претерпели существенные изменения, что выражается в увеличении удельного веса легких, стертых и бессимптомных форм, росте аллергического компонента, высокой частоте микст-инфекций. Это затрудняет традиционную диагностику заболеваний, поэтому значимость иммунодиагностики, направленной на поиск антигенов возбудителя или специфических иммунных сдвигов в организме больного, возрастает.

Под иммунореактивностью (иммунный статус, иммунный профиль) понимают способность иммунной системы к иммунному ответу в данный момент времени. Ее характеризуют концентрация иммуноглобулинов, количество лимфоцитов и лейкоцитов, соотношение Т- и В-клеток и функциональные показатели, в частности способность иммунокомпетентных клеток отвечать на стимуляцию.

15.7. Контроль качества лабораторных исследований

Важным элементом работы микробиологической и иммунологической лаборатории является получение точных и сопоставимых результатов анализов, для чего необходимо осуществлять контроль качества проводимых исследований. Контроль качества может быть внутрилабораторным и внешним.

Внутрилабораторный контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в отдельной лаборатории персоналом этой лаборатории и направлены на обеспечение соответствующего качественного уровня работы лаборатории.

Внешний контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в рамках единой Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) лабораторных исследований группами экспертов и направлены на обеспечение правильной организации технологических процессов производства лабораторных исследований.

Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований состоит из разделов, в рамках каждого из которых

выполняется оценка качества определенного вида лабораторных исследований. В структуру ФСВОК входят экспертные группы по разработке и проведению внешнего контроля качества в различных видах лабораторных исследований.

Задания для самоподготовки (самоконтроля)

A. Назовите метод микробиологического исследования, позволяющий установить вид возбудителя:

1. Аллергический.

2. Микроскопический.

3. Культуральный.

4. Биологический.

Б. Назовите основную задачу бактериологического метода исследования.

B. У больного с подозрением на вирусную инфекцию на 7 день заболевания была взята сыворотка, в которой обнаружены специфические противовирусные антитела. Оцените достоверность полученного результата исследования.

Г. Назовите тип лаборатории, в которую следует направить материал от больного с подозрением на особо опасную инфекцию.

Капельная проба.

Для постановки кожных капельных проб применяются водные растворы веществ. Обычно употребляются невысокие концентрации аллергенов, например, 0,25% раствор новокаина, 50000 пенициллина. Каплю раствора аллергена наносят на неповрежденную кожу (волярную поверхность) предплечья, живота. Параллельно ставят контрольную капельную пробу с растворителем (физиологическим раствором или дистиллированной водой).

Результаты капельной пробы регистрируются через 20 минут и спустя сутки с момента нанесения испытуемого раствора лекарственного вещества. Если в месте нанесения лекарства есть гиперемия, отек, то реакция положительная, данный препарат назначать нельзя.

Аппликационная кожная проба.

Аппликационные кожные пробы делают на волярной поверхности предплечья, на животе, спине. При этом на кожу накладывают марлю размером 2х2 см, смоченную раствором исследуемого лекарственного вещества. Сверху марли накладывают компрессную бумагу или целлофан, затем наклеивают кусок лейкопластыря 4х4 см. Аналогичным образом делают и с контрольным растворителем (физ.раствором).

Результаты оцениваются через 24-72 часа следующим образом: гиперемия (+); гиперемия, отечность, образование папул (++); яркая эритема, отечность, папулы, везикулы (+++); образование крупных пузырей и некроза (++++). Лейкопластырь в местах непосредственного контакта с кожей, как правило, вызывает раздражение кожи (непосредственная реакция-гиперемия, отек), поэтому оценивать нужно только участок кожи, непосредственно соприкасающийся с марлей, смоченной раствором лекарственного препарата.

В случае резкого нарастания аллергической реакции (появление зуда, чувства жжения и т.д.) пробу следует быстро снять и обмыть кожные покровы, и данное лекарство не назначать.

Скарификационная кожная проба.

Перед постановкой этой пробы - кожу (спины, живота или внутренней поверхности предплечья) следует обработать спиртом. Затем на расстоянии 5 см друг от друга наносят каплю 0,01% раствора гистамина (положительный контроль), каплю испытуемого лекарственного аллергена и каплю разводящей жидкости - физиологического раствора (отрицательный контроль). Стерильными иглами или скарификаторами наносят две поверхностные скарификации (не кровоточащие) в длину до 5-10 мм, на расстоянии 3 мм друг от друга. Реакцию оценивают через 20 минут, промокая капли аллергена отдельными ватными тампонами. Надо смотреть и через 24 часа (могут быть замедленные реакции).

Если на месте скарификации развивается гиперемия, а при натягивании кожи отек (побеление) в месте царапин, реакция слабоположительная (+).

Если волдырь с гиперемией в месте царапин виден на глаз, а при натягивании отек увеличивается, то реакция положительная (++).

Волдырь диаметром 10 мм с гиперемией и ложноножками свидетельствует о резко положительной реакции (+++).

Волдырь размером более 10 мм в диаметре с псевдоподиями и гиперемией показывает о реакции положительной в очень резкой степени (++++).

Провокационная подъязычная проба.

Перед проведением пробы осмотреть подъязычную область. Больному под язык дается 1/4 разовой терапевтической дозы испытуемого лекарственного препарата. При положительной пробе через 10-20 минут у больного появляется отек уздечки языка, отек губ, кожный зуд; единичные или распространенные уртикарные высыпания. При этом больной должен немедленно удалить оставшуюся часть препарата, прополоскать рот, не глотая жидкости, и принять антигистаминные.

Провокационная проба.

Пероральная:

Больному дается 1/4 разовой терапевтической дозы испытуемого лекарственного препарата. При положительной пробе в течение ближайших 2 часов могут появиться удушье, единичные волдырные элементы, повышение температуры. При этом больному дается солевое слабительное и назначаются антигистаминные препараты.

Парентеральная:

Четверть разовой дозы вводится внутримышечно в область бедра, если препарат вводится внутримышечно; п/к - в область предплечья, если препарат вводится подкожно и оценивается через 20 минут. При отрицательном результате через два часа вводится разовая доза. При проведении пробы с препаратом для внутривенного введения готовится раствор для внутривенного капельного введения и вводится медленно 10-20 капель в минуту в течении 2-5 минут. При отсутствии общих клинических симптомов и изменений гемодинамики введение лекарственного вещества продолжается.

Провокационные пробы проводятся врачом под контролем гемодинамики.

Тест торможения естественной эмиграции лейкоцитов in vivo для специфической диагностики лекарственной аллергии (ТТЭЛ)

Для ТТЭЛ необходимы:
Оборудование: (на одно исследование)

1. 4 химических стаканчика емкостью 50 мл.

2. 5 пробирок емкостью 20 мл.

3. Штатив для пробирок (1).

4. 2 пипетки (1,0 и 10,0 мл.).

5. Микропипетки (2).

6. Счетная камера Горяева (1).

7. Часовое стекло (1).

8. Микроскоп бинокулярный (об.20, ок.7)

Реактивы:

1. Физиологический раствор рН 7,3-7,4 (рН раствора устанавливается добавлением 0,1 М NаОН при помощи потенциометра ПП-0,1).

2. 0,01% раствор красителя генцианового фиолетового в 3% уксусной кислоте.

Медикаменты:

Для исследования используются водорастворимые формы медикаментов в следующих концентрациях:

1. Пенициллин - 1 мк/мл.

2. Цефалоспорины (цефазолин, кофзол, цефамизин)-1 мкг/мл.

3. Аминогликозиды (стрептомицин, канамицин, гентамицин)-10 мкг/мл.

4. Макролиды (эритромицин)-10 мкг/мл.

5. Хлорамфеникол (левомицетин) -10 мкг/мл.

6. Тетрациклины -10мкг/мл.

7. Сульфаниламидные препараты-100 мкг/мл.

8. Производные пиразолона и ацетилсалициловой кислоты-100 мкг/мл.

9. Местные анестетики (новокаин, лидокаин, тримекаин)-100 мкг/мл.

10. Антибиотики других химических групп - 10 мкг/мл.

Если у больного в анамнезе отмечались анафилактические реакции на введение медикаментов, то независимо от названия лекарственного препарата исследования начинают с концентрации препарата 1 мкг/мл. В случае отрицательного результата тест повторяют с этим же медикаментом в дозе 10 мкг/мл, а если необходимо - то с дозой 100 мкг/мл.

В один день можно проводить только одно исследование с одним препаратом и с одной его концентрацией. Во время проведения теста запрещается принимать пищу, пить, курить, принимать лекарственные препараты. Тест проводится в процедурном кабинете.

До и после постановки ТТЭЛ in vivo врач тщательно осматривает больного, измеряет АД, ЧСС, частоту дыхания.

Обследование рассчитано на 1,5 часа и состоит из двух этапов.

I-й этап:

Подготовка материала к исследованию:

1. Через час после еды больной тщательно прополаскивает полость рта кипяченой водой для механической очистки ее в течении 2-х минут.

2. Спустя 30 минут после первого полоскания следует прополоскать передний отрезок полости рта 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) в течение 2-х минут.

3. Жидкость из полости рта (промывные воды) собирают в стаканчик №1, как исходную порцию (контроль).

4. Через 15 минут производится полоскание полости рта в течение 2-х минут физиологическим раствором с разведенной в нем исходной концентрацией испытуемого медикамента. Эта порция промывной жидкости собирается в стаканчик №2 и в дальнейшей работе не используется.

5. Еще через 15 минут вновь ополаскивают передний отрезок полости рта в течение 2-х минут 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) и промывную жидкость собирают в стаканчик №3.

6. После этого через 15 минут передний отрезок полости рта ополаскивают в течение 2-х минут 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) и собирают промывную жидкость в стаканчик №4.

II-й этап:

Окраска и подсчет лейкоцитов в собранном материале. Приготовление и просмотр окрашенных мазков.

1. Промывную жидкость из полости рта в стаканчике №1 (контрольная порция) после получения тотчас тщательно перемешивают микропипеткой и в количестве 0,2 мл помещают на часовое стекло.

2. Туда же добавляют 0,04 мл раствора красителя генцианового фиолетового.

3. Через 5 минут исследуемую смесь помещают под притертое стекло камеры Горяева.

4. Подсчет лейкоцитов проводиться в 100 больших квадратах камеры Горяева и рассчитывает количество лейкоцитов в 1 кубическом мм.

Таким же образом подсчитывают количество лейкоцитов в стаканчиках № 3 и 4 (опытные порции)

Индекс эмиграции лейкоцитов в полости рта рассчитывают по формуле:

ИЭ =

х100%

111 Нк – Но 111

где Нк-количество лейкоцитов (нейтрофилов) в первой, исходной порции, Но-количество лейкоцитов (нейтрофилов) в опытных стаканчиках №3 и 4.

Тест оценивается как положительный при снижении числа клеток по индексу эмиграции более, чем на 30%.

Приложение №5 .

Аллергия - довольно распространенное состояние. Съев апельсин, погладив кошку, попав в пыльное помещение, получив укус пчелы, люди начинают чихать и чувствовать зуд в глазах, раздражение кожи, расстройство пищеварения. А ведь мало кто знает, что аллергия - критическое состояние, и иногда может привести к отеку верхних дыхательных путей, заканчивающемуся летальным исходом. Во многих случаях это можно избежать, если проводить раннюю диагностику заболевания.

Что такое аллергия?

Аллергией называют усиленную чувствительность организма к некоторым веществам, выражающуюся патологической реакцией. Смысл состояния заключается в следующем. Некоторые вещества являются аллергенами для иммунной системы человека. При первой встрече защитная система как бы «запоминает» их, а при повторной встрече выделяет большое количество биологически активных веществ (гистамин, лейкотриены, простогландины), вызывающих повреждение тканей организма и нарушение их функционирования. Это так называемая патофизиологическая стадия аллергии. Она может закончиться отеком Квинке и смертью человека от удушения, все это может развиваться в течение всего лишь несколько минут.

Особое значение в развитии аллергической реакции имеют иммуноглобулины класса Е . Именно они реагируют при повторной встрече с аллергенами и фиксируются вместе с ними на поверхности мембран базофилов и тучных клеток, вызывая освобождение БАВ.

Существуют разные группы аллергенов:

• Пищевые продукты.
• Продукты жизнедеятельности животных и растений.
• Лекарства.
• Бытовые (самое извсетное - пыль).
• Вещества, попадающие в организм при непосредственном контакте с насекомыми.
• Химико-промышленные соединения.

Диагностика аллергии важна, поскольку позволяет выявить гиперчувствительность организма к тому или иному продукту или животному или растению до проявления патологии и избежать повторной встречи.

Методы диагностики аллергии

К основным мероприятиям, позволяющим определить повышенную реактивность человека, относятся:

1. Кожные пробы.
2. Анализ на содержание иммуноглобулинов Е в крови.
3. Провокационные тесты.
4. Элиминационные тесты.

Кроме того, следует помнить о противопоказаниях к проведению анализов. Это:

• Детский возраст до пяти лет.
• Возраст после 60 лет.
• Противопоказано для беременных или женщин, кормящих грудью.
• При обострении патологий других систем органов.
• Нельзя проводить пациентам, принимающим гормоны в качестве терапии.
• Нельзя, если в истории болезни указан хоть один случай анафилактического шока.

Рассмотрим каждую из диагностик подробнее.

Кожные пробы

Их проводят с целью выявления, есть ли у человека чувствительность на определенное вещество. Пробы можно ставить несколькими способами:

• Метод скарификации . Очищенное и подготовленное предплечье пациента размечают на «ячейки» или квадраты. На каждый участок наносят каплю аллергена, после чего через нее делают царапину. Метод, как и последующие, бескровный и абсолютно безболезненный.
• Аппликационные пробы . Кожу при этом виде не царапают, а просто прикладывают смоченные в растворе ватные тампоны.
• Прик-тест . Общий смысл тот же, что и в скарификационном, только производят не царапины, а уколы с помощью специальной иглы.
• Введение под кожу растворов аллергенов.

За один подход можно определять не более 15 компонентов. Существует огромное количество препаратов, сделанных из шерсти домашних животных, перьев птиц, пыльцы растений, пыли, микроскопических грибов, пищевых продуктов и химических соединений.

Положительной реакция считается в том случае, если в месте нанесения отмечается покраснение, зуд или небольшой отек кожи.

Пациента проверяют обычно через 24-48 часов, но иногда чувствительность может проявляться уже через 15-30 минут.

Результат анализа выдается в виде списка, где указано на какие из аллергенов есть положительная реакция, причем есть разные степени её выраженности: сильная, слабая, сомнительная, отрицательная.

Анализ на Ig E в крови

В норме иммуноглобулины класса Е обнаруживаются в крови в незначительных количествах. Однако повышение уровня этих тел может говорить о наличии таких заболеваний, как: аллергический ринит, крапивница, системная анафилаксия. Метод очень информативный, однако действует только в случае IgE-зависимых аллергий, к счастью это самый распространенный тип аллергий. Кроме того, повышение этого класса иммуноглобулинов свидетельствует не только о чувствительности, но и о гельминтозах и бронхиальной астме.

Анализ Ig E эффективен больше у детей. Одно только повышение этих соединений не является 100-процентной гарантией наличия аллергии, нужно выявить аллерген-специфический антиген, который может быть ответственен за реакцию чувствительности.

Есть у метода и несомненные преимущества: его можно проводить и при обострении заболеваний других органов, он е противопоказан маленьким детям, пожилым людям, беременным и кормящим матерям.

В ходе пробы берут кровь из вены спустя 3 часа после последнего приема пищи.

Провокационные тесты

Иногда, когда результаты кожных проб не совпадают с симптоматикой, или картина слишком смазана, то назначают провокационные тесты. При этом методе небольшое количество аллергена вводят человеку непосредственно в легкие при помощи ингаляций или на слизистую оболочку носовой полости или под язык, на конъюнктиву. Реакция считается положительной, если наблюдаются покраснение и зуд (в случае глаз), чихание и ринит (в случае носовой полости).

Элиминационные тесты

Чаще всего применяется при диагностике пищевой аллергии. Если предполагается, что какой-то продукт вызывает аллергию, то проводят его элиминацию, то есть удаление из рациона . Если симптомы аллергии исчезли, то можно с уверенностью сказать, что аллерген выявлен.

При проведении любого вида диагностики аллергии важно прекратить заранее прием любых противоаллергических и противогистаминных препаратов. Кроме того, следует помнить о противопоказаниях к проведению анализов. Это:

Чаще всего применяются все методы, то есть используют комплексную диагностику. Одним из её важных моментов является ведение дневника врачом-аллергологом, в котором отмечается время начала аллергической реакции, ее продолжительность, характерные проявления. С помощью дневника можно установить сезонный характер чувствительности, например, по причине пыльцы какого-нибудь растения, а также разработать профилактические меры, например, избегать нахождения вблизи аллергенного объекта.

Таким образом, диагностика аллергии - распространенная, безболезненная, и, в большинстве случаев, безопасная процедура, позволяющая выявить аллерген и подтвердить наличие чувствительности. С помощью комплексных анализов можно выбрать стратегию лечения и профилактики, позволяющей избежать опасной патологии в будущем.

Специфические и неспецифические методы обследования больных аллергией

В статье перечислены применяемые современной медициной методы диагностики аллергии.

Физикальное обследование

Включает осмотр пациента, пальпацию, аускультацию (прослушивание звуков, сопровождающих работу органов) и перкуссию (прослушивание звуков при простукивании определённых участков на теле пациента).

Лабораторная диагностика аллергии

Лабораторный метод диагностики аллергии определяет состояние организма по взятым у пациента анализам. Большинство методов базируется на ИФА (иммуноферментный анализ) - специфической реакции антиген-антитело. На ИФА основаны метод множественной хемилюминисценции и иммунофлуоресцентный метод на аппарате ImmunoCAP.

Биохимический анализ крови

Изучает состояние внутренних органов и систем, наличие воспалительных процессов, определяя химический состав крови.

Скрининговое аллергологическое обследование

Объект исследования - сыворотка крови. Проводятся ИФА тесты на основные группы аллергенов. Метод позволяет сузить круг поиска виновного аллергена.

Определение специфических IgG

Объект - сыворотка крови. LgG-тест ИФА проводят с индивидуальными антигенами для точного выявления виновного аллергена.

Показания: диагностика пищевой аллергии и непереносимости.

• 50 Ед/мл - результат отрицательный;

• 50 - 100 Ед/мл - слабое нарушение толерантности;
• 100 - 200 Ед/мл - умеренное нарушение толерантности;
• более 200 Ед/мл - выраженное нарушение толерантности.

Исследование специфических антител IgE

IgE антитела отвечают за реакции немедленного типа. Определяются в сыворотке крови методом ИФА. Выявляется вызывающий аллергию агент.

Показания: невозможность выявить аллерген через анамнез, отказ от кожных проб, системные реакции в анамнезе, дерматит, гипо- и гиперреактивность кожи, количественная оценка антител, lgE-зависимая пищевая аллергия.

Забор крови производится из локтевой вены. За несколько дней до сдачи крови исключают аллергенные продукты из диеты и контакт с животными, прекращают приём антигистаминных препаратов. Анализ проводится в период ремиссии, кровь берут натощак..

Нормальное (референсное) значение lgE в крови - менее 0,35 МЕ/мл

При выявлении lgE-зависимой аллергии показана аллерген-специфическая иммунотерапия

Исследование газового состава крови

Определяется pH, парциальное давление О2 и СО2, количество бикарбоната в крови пациента.

Исследование гормонального профиля

В крови измеряется уровень гормонов коры надпочечников.

Клинический анализ мочи

Оцениваются физико-химические характеристики мочи: цвет, прозрачность, плотность, кислотность, химический состав. В осадке определяют наличие эпителия, эритроцитов, лейкоцитов, бактерий.

Копрограмма

Используется при диагностике пищевой аллергии.

Общий анализ мокроты

Применяется при диагностике дыхательной аллергии. Исследуются количество,консистенция, цвет, запах, характер (слизь, гной, кровь, серозная жидкость), флора, форменные элементы.

Ревматологические пробы

Объект - кровь. Анализируется уровень ревматологического фактора, фибриногена, С-реактивного белка и антистрептолизина. Метод позволяет установить наличие, локализацию и источник воспаления соединительной ткани.

Вирусологические исследования

Объекты: кровь, кал, мокрота, спинномозговая жидкость. Определяется присутствие вирусов в организме.

Бактериологический анализ мокроты и других выделений (секретов) со слизистых и кожи

Производится посев образца в питательную среду и последующий анализ выращенных колоний. Позволяет выявить и количественно оценить наличие возбудителей инфекционных заболевании.

Цитологическое исследование секрета, мазков или смывов из полости носа, слизистой конъюнктив и др

Метод состоит в исследовании под микроскопом клеток, находящихся во взятом образце, для выявления их морфологических патологий и поражений и их причин.

Специфические методы аллергологического обследования

Данная группа методов диагностики аллергии проводится на пациенте и направлена на выявления агента, вызывающего аллергию.

Кожные пробы (скарификационные)

Производится оценка местной реакции на контакт аллергена с кожей.

Существуют следующие виды кожных проб:

капельные : препарат аллергена наносится в виде капли на неповреждённую кожу;

Пример проведения капельной диагностики (можно увеличить)

аппликационные или patch-тесты: на неповреждённую кожу наносится ткань,пропитанная аллергеном;

скарификационные: аллерген вводится через царапины на коже;

внутрикожные: препарат аллергена вводится внутрь кожи шприцем.

prick тесты : аллерген вводится через укол иглы, смоченной препаратом аллергена.

Показания: данные анамнеза, указывающие на аллергическую природу заболевания.

Противопоказания:

Причины ложных результатов:

• Нарушение технологии проведения пробы;
• Неправильное хранение препаратов аллергенов;
• Пониженная реактивность кожи;
• Приём антигистаминных препаратов.

Положительный результат указывает на сенсибилизацию организма, при совпадении с результатами анамнеза делается вывод об аллергической природе заболевания, при несовпадении проводятся дополнительные тесты.

При положительной реакции на пробу Манту проводится дифференциальная диагностика поствакцинальной и инфекционной аллергии, то есть определяется, что вызвало местную реакцию - палочка Коха или антитела без инфекции.

Тест проводится врачом-аллергологом, с применением растворов аллергенов, помещаемых на кожу предплечья. Одновременно наносится до 15 проб.

Фрагмент сюжета телеканала МИР - проведение прик-тестирования детям

Элиминационные тесты

На несколько недель исключается контакт пациента с вероятными аллергенами, что приводит у улучшению общего состояния. При возобновлении воздействия искомого аллергена у больного снова проявляются симптомы аллергии.

Таким образом можно точно определить вещество, вызывающее аллергическую реакцию. Метод наиболее эффективен при пищевой, лекарственной аллергии и контактных дерматитах.

Провокационные тесты

Аллерген наносится на слизистую оболочку органа-мишени, возникает местная аллергическая реакция.

При диагностике аллергии используются следующие виды провокационных тестов:

• Назальный (показания: полиноз, ринит): аллерген помещают в ноздрю;
• Конъюнктивальный: аллерген закапывают под нижнее веко;
• Подъязычный (пищевая аллергия): аллерген закапывают под язык;
• Ингаляционный (показания: бронхиальная астма): вдыхается аэрозоль препарата аллергена;
  • Ингаляционный тест с карбахолином : подтверждение диагноза бронхиальной астмы;
  • Ингаляционный тест с холодным воздухом : исследование неспецифической гиперреактивности бронхов;
• Дополнительные методы аллергологического обследования:
  • Дункан-тест (на холодовую аллергию): помещают на кожу кусок льда на 20 минут;
  • Тепловой тест (на тепловую аллергию): помещают на кожу предплечья бюкс с горячей водой (40 о С) на 10 минут.

Функциональные методы диагностики аллергии

Позволяют оценить работу физиологических систем организма посредством инструментального измерения внешних проявлений их работы.

При диагностике аллергии оценивают работу лёгких и дыхательных путей:

Проведение пикфлоуметрии при астме (можно увеличить)

• Пикфлуометрия - измерение пиковой скорости выдоха;
• Спирометрия и спирография - измеряются скоростные и объёмные характеристики дыхания;
• Пневмотахометрия - измерение скорости воздуха при форсированном вдохе и выдохе.

Инструментальные методы обследования

Арсенал инструментальных методов диагностики аллергии включает в себя:

• Переднюю риноскопию: диагностика поражений слизистой оболочке носа.
• Переднюю риноманометрию: измеряет сужение просветов носовых ходов вследствие назального аллерготеста.
• Эндоскопические исследования: осмотр внутренних органов посредством эндоскопа.

Кроме вышеперечисленных традиционных, существуют альтернативные методы диагностики аллергии.

Альтернативные методы диагностики аллергических заболеваний

Если аллергическое заболевание проявляется нехарактерными симптомами, или затруднена диагностика традиционными способами, прибегают к альтернативным методам диагностики аллергии.

Лейкоцитотоксический тест

Определяется количество лейкоцитов, несущих специфический антиген. Наличие антигена определяется по изменению внешнего вида лейкоцита при его реакции с подозреваемым аллергеном.

Aллергологический тест на выявление IgG в ИФА

Применяется при выявлении вызывающего аллергию агента и диагностике пищевой непереносимости.

Так выглядит проведение вегето-резонансного тестирования (можно увеличить)

VEGA-тестирование (электродермальное тестирование) метод Фоля (Voll)

Исследование электромагнитной проводимости в организме. Пониженная проводимость указывает на аллергический процесс.

Анализ волос и тестирование аллергии

Аурикулокардиальный рефлекс

Оценивается изменение пульса и кровенаполнения при контакте с аллергеном.

Для безошибочной постановки диагноза аллерголог при обследовании использует поочерёдно несколько из перечисленных методов диагностики аллергии.

Программа «Алло, доктор!». Современные методы молекулярной диагностики аллергии

Диагностика аллергии методом кожного тестирования

Прежде чем начать лечение заболевания аллергологического характера, проводится диагностика аллергии, направленная на точное установление аллергена, вызывающего негативную реакцию. Как правило, анализ на выявление аллергена проводится путем кожных проб, специальных (провокационных) тестов, а также методом иммунологических лабораторных исследований. Здесь вы можете ознакомиться с подробным обзором всех вышеперечисленных методов диагностики аллергических заболеваний и особенностями их проведения.

Диагностика аллергических заболеваний: прямые и косвенные признаки

Первый и крайне важный этап диагностики аллергических заболеваний - правильно собранная история болезни. Данные, которые пациент сообщает врачу во время первого приема, позволяют направить дальнейшее аллергологическое обследование в нужном направлении.

Существуют прямые и косвенные признаки, указывающие на чувствительность к аллергенам. Например, прямой признак бытовой аллергии - появление клинических признаков заболевания во время уборки помещения, во время игры с мягкими игрушками, при посещении цирка или зоопарка и так далее. Косвенные признаки бытовой аллергии - частые обострения заболевания дома, проявление симптомов чаще ночью в постели, а не на улице при прогулке.

К прямым признакам пыльцевой аллергии относится появление заболевания (или усиление признаков заболевания) при контакте с цветущими растениями, использовании парфюмерии с цветочной пыльцой, применении средств фитотерапии. Косвенно на пыльцевую аллергию могут указывать обострения в весенне-летне-осенний период, появление реакции при употреблении в пищу меда, орехов, яблок, груш, слив.

Структура аллергенов (при IGE-зависимых аллергических реакциях) выглядит следующим образом.

Выработку IgE могут вызвать аллергены белковой природы или комплекс белка с углеводом. Полисахариды не способны сами вызывать стимуляцию образования IgE.

По молекулярной массе и иммуногенности антигены делятся на две группы: полные антигены и гаптены.

К полным антигенам относятся антигены пыльцы, эпидермиса, сыворотки животных и другие. Они способны самостоятельно вызвать синтез IgE антител. Основу полного антигена составляет полипептидная цепь.

Неполные антигены, или гаптены, - низкомолекулярные вещества, сами по себе не являются аллергенами. Попадая в организм, гаптены образуют комплекс с тканевыми или сывороточными белками, и уже этот комплекс выступает в роли аллергена.

Различия между полными антигенами и гаптенами имеют принципиальное значение в диагностике аллергических заболеваний. Полные антигены можно идентифицировать с помощью диагностических препаратов при кожном тестировании. Однако определить гаптен и изготовить на его основе диагностический препарат практически невозможно (исключение составляют только пенициллины).

Выявлению аллергенов способствуют кожные пробы, провокационные тесты, лабораторные анализы.

Как выявить аллерген: лабораторный тест на аллергическую реакцию

Лабораторные иммунологические тесты. Наиболее отработанный аллергический тест, проводимый в лабораторных условиях, - это определение аллерген-специфических IgE антител в сыворотке крови. Лабораторные методы могут лишь установить наличие какого-либо звена аллергического процесса, но не отражают картину в целом. Тест на аллергическую реакцию - это результат одновременного участия всех составляющих сложного механизма иммунологического процесса. Он принципиально не может быть получен в лабораторных условиях, поэтому тесты используются как вспомогательный, хотя и важный, инструмент диагностики и не могут заменить проведение испытаний на самом больном.

Как проводят тест на аллергию: кожные пробы

Кожные пробы. В диагностике большинства аллергических заболеваний используется постановка кожных диагностических проб.

Кожные пробы на аллергены малоинформативны при обширном поражении кожи. Для диагностики лекарственной аллергии кожное тестирование используется крайне редко, поскольку обычно аллергию вызывает не сам препарат, а его метаболиты, определить которые невозможно. Из лекарств кожные пробы проводятся только с белковыми аллергенами - например, с инсулином, сыворотками и пенициллинами.

Помимо местной реакции при проведении кожных проб могут возникнуть и общие реакции, как правило, через 10-180 минут после тестирования. Наличие общих реакций служит надежным доказательством чувствительности организма к аллергену.

Перед тем как выявить аллерген, медики обязательно учитывают особенности проведения кожных проб:

• Кожное тестирование проводят только в период ремиссии заболевания.
• Кожное тестирование целесообразно выполнять не ранее чем через 3-4 недели после системной аллергической реакции.
• Все виды кожных проб могут дать системную реакцию в виде анафилактического шока или обострения со стороны шокового органа.
• Перед кожным тестированием на аллергию следует заранее отменить прием антигистаминных препаратов, причем срок отмены во многом зависит от вида препарата.

Среди кожных проб выделяют аппликационные пробы, тест уколом (прик-тест), скарификационные и внутрикожные пробы.

Проведение скарификационных кожных проб

Скарификационные кожные пробы применяют при подозрении на сенисбилизацию к пыли (домашние клещи), пыльце, эпидермальным аллергенам и пище. Из всех видов кожных проб именно этот вид диагностики аллергии наиболее распространен в России.

Как проводят такие тесты на аллергию в амбулаторных условиях? При проведении скарификационных проб на кожу предплечья капают водные растворы различных аллергенов (пылевых, пыльцевых, пищевых) на некотором расстоянии друг от друга. В местах нанесения капель слегка повреждают кожу, не затрагивая кровеносных сосудов. Через 10 минут капли удаляют, а еще через 10 минут проверяют, не появились ли эритема (сильное покраснение) и волдырь.

Такие тесты довольно чувствительны, а техника их проведения менее стандартизована, чем проба уколом. Поэтому предпочтительнее проведение прик-теста.

Прик-тест, конъюнктивальный и назальный тесты для диагностики аллергии

Прик-тест - это метод диагностики аллергий путем прокола кожи через каплю раствора аллергена. Прокол должен быть достаточным по глубине, но не до крови. Оценку реакции проводят через 20 минут. Прик-тест редко дает ложноположительные реакции.

Конъюнктивальный тест - это проба на аллергию путем закапывания разведенного аллергена в глазную щель. Она проводится при подозрении на аллергический конъюнктивит. Проводится крайне редко в связи с непредсказуемой возможной тяжелой реакцией со стороны глаз.

Назальный провокационный тест - это аллергическое тестирование, которое проводится при подозрении на аллергический ринит. В носовой ход последовательно, через каждые 15-20 минут, закапывают несколько капель аллергена в возрастающих концентрациях (от 1/100000 до 1/10).

Аппликационное аллергическое тестирование

Аппликационные кожные тесты (патч-тесты) – это тест для диагностики аллергии, который используется при подозрении на контактный аллергический дерматит и фотоаллергические реакции. В последние годы обсуждается возможность их использования у больных атопическим дерматитом. Тесты проводятся на незатронутых повреждением участках кожи. Тест-аллергенами чаще всего служат различные химические вещества, в том числе и лекарства. Их применяют в чистом виде или в растворах в концентрациях, не вызывающих раздражения кожи у здоровых людей.

Для постановки и оценки кожных тестов требуется 3-4 визита больного к врачу. В первый раз осуществляется нанесение аллергена на кожу. Обычно раствором аллергена смачивают кусочек марли и закрепляют его на коже предплечья, живота или спины. Результаты оценивают через 20 минут, 5-6 часов и 1-2 суток. Если на месте аппликации аллергена возникло выраженное жжение и зуд, пациент должен обратиться к врачу. В этом случае лоскут снимают раньше. Реакцию оценивают, пользуясь специальной шкалой.

Анализ на выявление аллергена проведением внутрикожных и провокационных проб

Внутрикожные пробы (подкожные инъекции аллергена) почти не используются в диагностике. Проведение внутрикожных проб проводится очень редко из-за высокого риска системной реакции.

Провокационные пробы – это тестирование на аллергию методом выявления сенсибилизации (чувствительности), основанное на непосредственном введении аллергена в орган-мишень. Наиболее достоверный метод аллергологической диагностики, однако, и наиболее опасный. Предсказать реакцию больного на провокацию невозможно, поэтому требуется наличие строгих показаний для ее проведения. Так же как и кожные пробы, с аллергенами, провокационные пробы могут проводиться только в период полной ремиссии заболевания. По способу введения аллергена различают назальные, конъюнктивальные и ингаляционные провокационные пробы. У больных с пищевой аллергией подозреваемый пищевой продукт дается больному через рот.

Основное преимущество провокационных проб перед кожными, заключается в большей достоверности результатов. Недостатки же - в повышенном риске тяжелых аллергических реакций, сложность с количественной оценкой результатов. Кроме того, в один день можно провести пробу только с одним аллергеном.

Какие методы наиболее эффективны в диагностике причин аллергии

Когда Вы обнаруживаете у себя или своих близких расстройства здоровья, которые могут быть симптомами аллергии, необходимо обратиться к терапевту или дерматологу (в случае, когда симптомами являются кожные реакции).

Для лечения у специалиста аллерголога требуется направление, которое может быть выдано семейным врачом или дерматологом.

Диагностические симптомы аллергии

В первую очередь, самое главное, это интервью – он включает в себя определение семейной предрасположенности к образованию аллергических заболеваний и склонности к аллергическим реакциям в прошлом.

Врач спрашивает о симптомах заболеваниях: сезонные или круглогодичные риниты пазух носа, конъюнктивит, крапивница, одышка, понос, запор.

Тест на аллергию методом Прик-тест

National Institute of Allergy and Infectious Diseases, public domain

Предметное исследование пациента, указывающее на возникновение аллергии , является показанием к выполнению диагностических обследований, выявлению аллергена.

Диагностика аллергии позволяет начать эффективное лечения и снижает тягость симптомов аллергии, поэтому не стоит пренебрегать аллергической реакцией и рассчитывать на то, что болезни пройдут сами собой.

Диагностика аллергических заболеваний

Что делать, если вы заметили проявления аллергии у вашего ребенка? Это может быть насморк, чиханье, сыпь и зуд кожи, отеки век и губ в ответ на контакт с пыльцой растений, животными и насекомыми, продуктами питания или домашней пылью. Склонные к аллергии дети обычно сенсибилизированы к множеству аллергенов. Знать к каким именно родителям нужно для того, чтобы по возможности удалить их из среды обитания ребенка. Прекращение контакта с аллергеном – один из основных этапов лечения любого аллергического заболевания. Сегодня мы поговорим о методиках, применяемых для их диагностики.
Тестирование с диагностическими аллергенами проводит доктор-аллерголог в условиях аллергологического кабинета. Перед этим с родителями и ребенком ведется беседа, в ходе которой собирается подробная информация о течении заболевания. Будьте готовы ответить на вопросы доктора о первых симптомах, длительности, предполагаемых провоцирующих факторах, применяемых ранее лекарствах, других заболеваниях ребенка.

Далее проводится осмотр и назначается первичное обследование. Нужно сдать кровь и мочу для общего анализа, пройти флюорографию и ЭКГ. Будьте готовы к тому, что потребуется консультация дерматолога, оториноларинголога, невропатолога. Для диагностики аллергии у детей применяют кожные пробы и провокационные аллергические тесты. Существуют противопоказания к их проведению:

Острая фаза аллергического или любого другого заболевания;
острая инфекция любой локализации;
проведение глюкокортикостероидной или антигистаминной терапии;
декомпенсированное состояние при болезнях внутренних органов.

Когда же лучше выполнять пробы с аллергенами? Подозреваемую сенсибилизацию к пыльце диагностируют зимой за несколько месяцев до начала массового цветения, к бытовым аллергенам – летом, к аллергенам животных – через несколько месяцев после того, как устранен с ними контакт. То есть специфическая диагностика проводится во время наименьших проявлений аллергии, а лучше при полном их отсутствии.  

Скарификационные пробы:

Методика заключается в оценке реактивности кожи при контакте с различными антигенами. Для пробы используют диагностические аллергены в малом разведении (10000 PNU). Кожа волярной поверхности предплечья обрабатывается раствором антисептика. От лучезапястного сустава отступают 5 см и делают стерильным скарификатором первую насечку. На нее наносят 0,01% раствор гистамина, чтобы оценить нормальный ответ кожных покровов. Отступив 5 см, новым скарификатором делают еще насечку и наносят контрольную жидкость, чтобы зафиксировать для сравнения отрицательную реакцию. Далее на расстоянии 5 см друг от друга наносят капли аллергенов. В каждой капле своим скарификатором делают 2 параллельные насечки длиной до 5 мм. Результат оценивают спустя 20 мин.
Реакцию кожи на экзогенный антиген в виде волдыря над зоной гиперемии считают положительной и характеризуют по шкале от + до ++++. Наличие волдыря больше 5 мм и псевдоподий говорит о резкоположительной реакции (+++ и ++++).

Прик-тест (проба уколом):

Более современная и чувствительная методика. На кожу предплечья с внутренней стороны наносятся капли аллергенов, растворителя и 0,1 % гистамина на расстоянии 2-4 см друг от друга. Капли прокалывают иглой из стандартного одноразового набора. Время оценки результата короче: на гистамин – через 10 мин, пыльцевые аллергены – 15 мин. Шкала оценки подобна таковой для поверхностных проб.

Внутрикожная проба:

При сомнительных результатах поверхностных кожных проб у детей с предполагаемой сенсибилизацией к определенным антигенам их вводят внутрикожно с помощью инсулиновых шприцов.  
Простерилизовав кожу волярной поверхности предплечья, поочередно вводят 0, 02 мл жидкости (сначала контрольной, затем испытуемых аллергенов). Разведение препарата аллерголог подбирает индивидуально: начиная с 1 PNU и заканчивая 1000 PNU. Регистрацию результата пробы проводят через 20 мин с помощью шкалы плюсов. О резкоположительном ответе говорит волдырь с псевдоподиями размером более 15 мм на фоне покраснения кожи.

Провокационные тесты:

Бывают дети, у которых из-за сильной реакции капилляров кожи на механическое повреждение скарификационная проба дает ложноположительный результат. В таких случаях аллерголог может порекомендовать назальное капельное или ингаляционное введение аллергена. Тестирование должно проводиться лишь в узкоспециализированном стационаре, где при возникновении анафилактической реакции ребенку окажется немедленная помощь.
Капельный тест показан при рините, вызванном пыльцой растений или домашней пылью. В одну ноздрю сперва закапывают 3 капли жидкости-контроля. Если спустя 15 мин никакой реакции не возникло, капают 3 капли аллергена в разведении, при котором возникла ложноположительная реакция внутрикожного теста (волдырь до 4 мм, что рассасывается медленнее, чем в контроле). Если реакции слизистой носа через 15 мин не последовало, концентрацию увеличивают. Провокационный назальный тест положителен при появлении чихания, чувства заложенности носа, слизистых выделений.

Лабораторные методики:

Позволяют определять моноклональные Ig E в период обострения аллергии, при высокой активности аллергического ответа. Широко применяется у детей. С помощью сертифицированных диагностиков в крови определяют специфические иммуноглобулины к предполагаемым антигенам.

PRIST – метод определяет концентрацию в сыворотке неспецифического Ig E с помощью тест-полоски, пропитанной радиоиммуносорбентом.  

RAST – методика основана на связывании специфического Ig E сыворотки с аллергеном, зафиксированном на тест-пластинке. Общий Ig E отмывают. К содержимому добавляют меченые I125   антитела к Ig Е. Образовавшееся радиоактивное соединение фиксирует сцинтилляционный счетчик.

ИФА – сыворотку крови ребенка наносят на специальную поверхность, на которой адсорбированы антигены (полистирольный планшет или микроцеллюлозные диски). Чтобы определить концентрацию специфических Ig E добавляют к ним меченые антитела и соответствующие реагенты, которые воспроизводят реакцию в цвете. Ее интенсивность оценивается фотометрически.
Реакция выявления специфических Ig E – современная аллергодиагностика, которой должно отдаваться предпочтение. Однако в некоторых клинических случаях не потеряли своей актуальности тесты для диагностики антителзависимых реакций, реакций замедленного типа.

• анамнез, осмотр, аускультация, осмотр ЛОР-органов;
• кожные пробы (прик - тест, скарификации) с широким спектром аллергенов;
• провокационные пробы (назальный, конъюнктивальный и ингаля-ционный);
• иммунологическое обследование скрининговое;
• исследование интерферонового статуса;
• скрининговое аллергологическое обследование (определение методом ИФА уровня специфических IgE, IgG антител к бытовым, эпидер-мальным, пищевым, пыльцевым аллергенам);
• исследование функции внешнего дыхания (ФВД);
• общие анализы крови, мокроты, цитология назального секрета - по показаниям.

Первичная консультация врача аллерголога - иммунолога начинается с опроса пациента. При диагностике аллергии необходимо выяснить у пациента, когда впервые появились симптомы заболевания, условия их возникновения и развития, в каких случаях аллергическая реакция выражается максимально, условия быта и работы, наличие животных, имеются ли аллергические заболевания у родственников и т.д.

Следующий этап - диагностики аллергических заболеваний постановка кожных проб (прик - тест, скарификации) с пыльцевыми, бытовыми, эпидермальными, пищевыми аллергенами.

При проведении кожных тестов на кожу наносятся или внутрикожно вводятся определенные аллергены. По реакции на них (покраснение, появление аллергической реакции в месте нанесения/введения аллергена) судят о наличии аллергии.

Для выявления скрытого бронхоспазма проводится исследование функции внешнего дыхания (ФВД).

Пациентам с частыми простудами, обострениями хронических заболеваний, герпесом, аллергическими заболеваниями, с хронической ЛОР-патологией, длительным субфебрилитетом, иммунодефицитными состояниями и пр. проводится исследование иммунного (определение состояния иммунной системы) и интерферонового статуса.

Что такое иммунограмма

Иммунограмма - это исследование основных показателей иммунной системы человека. Обычно определяются основные параметры иммунной защиты человека: количество и функциональная способность (например фагоцитарные индексы) лейкоцитов, их процентное соотношение; клеточный иммунитет - общее количество Т-лимфоцитов и их популяции; гуморальный иммунитет - уровень иммуноглобулинов (антител) классов А, М, G, Е и количество В - лимофоцитов; определение показателей системы комплимента и интерферона.

После обнаружения аллергена, установления причины заболевания назначается лечение. В настоящее время разработано огромное количество способов иммуно-аллергологического обследования пациентов, включающих самые современные методы диагностики аллергии. Врач аллерголог-иммунолог в каждом конкретном случае составляет индивидуальный план обследования. Ведьправильный диагноз и составление плана лечения возможно только после комплексного обследования.

7039 0

Эти методы могут широко использоваться при аллергических заболеваниях в фазе обострения, в периоды массивного контакта с аллергеном, при высокой чувствительности заболевших к аллергену, при наличии противопоказаний, у детей, при идентификации профессиональных аллергических заболеваний, так как исключают возможность появления неспецифических, ложноаллергических реакций.

Среди различных способов специфической аллергодиагностики при реагиновом IgE-зависимом типе более предпочтительно определение моноклональных IgE.

Существуют непрямые методы определения IgE и наиболее распространенные прямые методы выявления специфических IgE, основанные на новых технологиях и использовании диагностикумов в виде стандартизованных и сертифицированных аллергенов к ним.

Реакция пассивного переноса по Праустнитцу—Кюстнеру (непрямой метод постановки кожной пробы) чаще используется в детской практике при идентификации пищевой аллергии. Сущность метода заключается в реакции пассивного переноса реципиенту сенсибилизации с помощью внутрикожного введения 0,1 мл сыворотки крови больного с наличием в ней предполагаемых специфических IgE. Спустя 24 ч в этот же участок вводят 0,02 мл предполагаемого аллергена. Реакцию регистрируют через 20 мин. Однако угроза переноса СПИДа, вирусного гепатита и других инфекций не позволяет широко использовать данный метод.

Определение специфических IgE

Исследование общего IgE осуществляется с помощью бумажного радиоиммуносорбент-ного теста (метод PRIST), определение аллергоспецифического IgE — радиоаллергосорбентного теста (метод RAST). Наряду с ними в настоящее время для определения аллергоспецифичес-ких IgE все шире используется способ иммуноферментного анализа (ИФА).

Метод RAST наиболее специфичен и точен, так как основан на использовании радиоактивной метки. Сущность его заключается в связи специфического IgE исследуемой сыворотки с аллергеном, размешенным на бумажной пластинке. После отмывания неспецифического (общего) IgE в содержимое добавляются меченые 125I антитела против IgE. Образовавшийся радиоактивный комплекс считывается на сцинтилляционном счетчике.

Метод ИФА

Сыворотка обследуемого, содержащая специфические IgE, наслаивается на полистирольную поверхность микропланшет с адсорбированным набором аллергенов, с которыми связываются только определенные специфические IgE.

При точечном иммуноанализе аллергены наносятся в виде точек на нитроцеллюлозные диски.

Для определения концентрации специфических IgE, связанных с аллергеном, добавляются антиантитела (меченные ферментом) к IgE. На следующем этапе с помощью специальных реагентов, воспроизводящих цветную реакцию, интенсивность которой зависит от концентрации специфических lgЕ в комплексе с аллергеном, определяют содержание специфических lgЕ фотометрически в вертикальном луче в системе «Унискан» или «Мультискан». В норме она не превышает 210 МЕ/ед.

Наряду с выявлением специфических lgЕ используются и другие лабораторные тесты для диагностики как антителозависимых реакций (определение показателей специфического повреждения базофилов, аллергических антител в реакции пассивной гемагглютинации, реакция связывания комплемента и др.), так и реакций замедленного (клеточного) типа (реакция торможения миграции лейкоцитов крови — РТМЛ, тест розеткообразующих клеток — РОК, тест повреждения нейтрофилов и др.).

Их применение в аллергологической практике не потеряло своего значения — идентификация повышенной чувствительности к аллергенам, аутоантигенам позволяет осуществлять более целенаправленное лечение и реабилитацию больных.

Реакция прямого специфического повреждения базофилов крови

Базофилы крови, тучные клетки — клетки-мишени в реализации аллергических реакций немедленного типа. lgЕ с помощью Fс-фрагмента фиксируются на рецепторах мембран этих клеток, а с помощью Fаb-фрагмента специфически реагируют с аллергеном. Это сопровождается резкой активацией (дегрануляцией) клеток-мишеней, что и используется в качестве маркера аллергической реакции.

Для постановки реакции 5 мл исследуемой крови добавляют в центрифужную пробирку с 5 каплями 6 % водного раствора трилона Б и инкубируют в течение часа при 37 °С. Образовавшуюся взвесь лейкоцитов с помощью пастеровской пипетки переносят в чистую пробирку, а затем разливают в две центрифужные пробирки по 0,3 мл. В первую пробирку (опытную) добавляют 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия, в котором растворена рабочая доза аллергена, во вторую (контрольную) — 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия без аллергена.

Обе пробирки инкубируют в течение 10 мин при 37 °С, затем центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. После чего сливают надосадочную жидкость, а лейкоцитарную массу, оставшуюся на дне пробирки, осторожно встряхивая, разбивают в остатке жидкости, стекающей со стенок. С помощью пастеровской пипетки содержимое каждой пробирки переносят на отдельные предметные стекла (в виде капли на край) и шлифованным краем другого стекла готовят тонкие лейкоцитарные мазки.

Мазки окрашивают эозин-метиленовым синим по Май—Грюнвальду в течение 1—2 мин после просушивания на воздухе. После промывания препарата в метиловом спирте мазки-препараты микроскопируют с иммерсией (увеличение 10 х 80). Просчитывают 50 базофилов по краям мазка и число поврежденных средних клеток. Показатель поврежденных клеток в опытном и контрольных препаратах определяют по формуле:

Реакция считается положительной при показателе 1,4 и выше.

Л.А. Дуева с соавт. (1986) подобрали рабочие концентрации и дозы химических аллергенов и антибиотиков для реакции прямого специфического повреждения базофилов крови (табл. 4).

Таблца 4. Рабочие концентрации и дозы реагентов для РСПБ

Тест деструкции тучных клеток

Для получения взвеси тучных клеток вводят внутрибрюшинно крысе 8—10 мл (мыши — 2—5 мл) подогретого до 37 °С изотонического раствора хлористого натрия, приготовленного на 0,15 моль фосфатном буфере с рН 7,2, слегка массируют живот. Суспензию тучных клеток отмывают изотоническим раствором хлористого натрия, затем центрифугируют при 500 об/мин.

Суспензию тучных клеток (0,02 мл) и сыворотку больного (0,02 мл) инкубируют 15 мин при 37 °С, затем вносят 0,02 мл аллергена в предварительно подобранной концентрации и снова инкубируют 15 мин при 37 °С. Одномоментно готовят три контроля: тучные клетки без сыворотки и без аллергена; тучные клетки с сывороткой без аллергена; тучные клетки с аллергеном без сыворотки.

После окраски образцов 0,025 % раствором толуидинового синего или 0,3 % раствором нейтральной краски заполняют суспензией тучных клеток камеры Горяева и подсчитывают окрашенные клетки, сравнивая число гранулированных клеток в контроле и опыте. Наблюдаемая дегрануляция тучных клеток в испытуемом образце считается слабоположительной при наличии 10—20 % дегрануляции, положительной — при 21—40 %, резкоположительной — при дегрануляции более 40 % клеток по сравнению с контролем.

Концентрация аллергенов, не вызывающая спонтанной дегрануляции, для антибиотиков — 100—1000 ЕД/мл, калия бихромата и йодида, натрия хромата, никеля сульфата — 0,01—0,1 % раствора, формальдегида — 0,2—0,4 %. Бытовые аллергены используются в дозе от 10 до 100 PNU.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) позволяет обнаруживать антитела к водорастворимым и водонерастворимым аллергенам.

Реакция основана на феномене агглютинации эритроцитов, сенсибилизированных in vitro к химическим аллергенам, при добавлении сыворотки пациента, содержащей антигаптенные антитела.

Реакция торможения миграции лейкоцитов крови (РТМЛ) основана на способности сенсибилизированных Т-лимфоцитов (например, к гаптенам) выделять лимфокин — фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов. С помощью РТМЛ раскрывается реакция клеточного типа (неантителозависимая) к различным антигенам.