Олигонуклеотид – это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты менее 50 нуклеотидов в длину. В течение последних 20 лет, смысл расширился, чтобы включать в себя все химически синтезированные нуклеиновые кислоты, независимо от длины. Первая публикация о направленном химическом синтезе олигонуклеотида появилась в 1955 году.
С тех пор, миллионы олигонуклеотидов синтезируются каждый год для использования в лабораториях по всему миру. Для большинства исследований нужны лишь небольшие количества ДНК. Гораздо большее количество ДНК (10 мкмоль или более) необходимы для использования в биофизических исследованиях (ЯМР и рентгеновской кристаллографии) поэтому, чтобы обеспечить синтез столь больших количеств, были разработаны методы твердофазного синтеза, что позволяет использовать олигонуклеотиды в качестве молекул лекарственного средства (например, антисмысловые олигонуклеотиды).
Синтез ДНК или РНК олигонуклеотидов относится к химическому синтезу фрагментов нуклеиновых кислот с определенными химическими структурами или последовательностей в различных размерах.
Рис.1. Структуры олигонуклеотидов.
Принцип твердофазного синтеза впервые был разработан и применен для синтеза полипептидов Роберта Брюса Меррифилда, американского биохимика, который получил Нобелевскую премию по химии в 1984 году за изобретение твердой фазы синтеза пептидов. Он понял, что ключ к успешному синтезу заключается в закреплении первого мономера к нерастворимой полимерной твердой фазе. Другие мономеры затем могут быть соединены, один за другим, к неподвижному терминальному концу растущего полимера. В конце синтеза, завершенная полимерная цепь может быть отсоединена от нерастворимого полимера и очищена. Этот процесс был оптимизирован на протяжении многих лет, чтобы стать высокоэффективным и теперь стал принципиально важным методом, используемым в автоматизированных олигонуклеотидных синтезаторах.
Для обеспечения успешного синтеза олигонуклеотидов необходимы следующие условия:
- Все реагенты должны быть растворимы в неводных растворителях.
- Амино- и гидроксильные группы нуклеотидных оснований и углеводных остатков должны быть соответствующим образом блокированы.
- Защитные группы, введенные в процессе синтеза, должны быть стабильными в условиях удлинения цепи при образовании межнуклеотидной фосфодиэфирной связи.
- Защитные группы должны быть достаточно лабильными, чтобы их можно было удалить в конце синтеза, не повредив продуктов реакции.
Функции олигонуклеотидов и перспективы их применения
В настоящее время олигонуклеотиды и их аналоги широко используются в различных областях, таких как медицина и в молекулярно-биологических исследованиях, а также рассматриваются в качестве перспективных терапевтических средств и зондов для молекулярной диагностики.
За последние 20 лет относительно хорошо были изучены только два типа аналогов нуклеиновых кислот с формально электронейтральным остовом – пептидные нуклеиновые кислоты и фосфордиамидные морфолиноолигонуклеотиды. Аналоги обоих типов способны к комплементарному связыванию с природными молекулами ДНК и РНК, и в силу этого они нашли применение как в молекулярной биологии, так и, в особенности, в медицине в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Кроме того, с развитием ДНК-технологий появилась возможность изучения экспрессии известных генов, определения мутаций в геномах различных организмов и проведения диагностики ряда инфекционных заболеваний. В решении этих задач наиболее перспективным является использование ДНК-чипов, представляющих собой небольшие пластины с нанесенными на их поверхность фрагментами ДНК.
Способ создания ДНК-чипов объединяет методы, основанные на адресном синтезе олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа. Синтез проводят путем поэтапного добавления к растущей олигонуклеотидной цепи нуклеотидов, содержащих на 5’-конце лабильную защитную группу, снятие которой возможно под действием светового излучения, электрического напряжения или в ходе кислотного гидролиза.
Показано, также, что ген-направленные олигонуклеотиды, в зависимости от выбранного гена-мишени, отличаются значительным разнообразием модулирующих эффектов на опухолевые ткани, начиная от замедления и остановки пролиферации опухолевых клеток и заканчивая подавлением их инвазивных свойств.
Противоопухолевые препараты на основе нуклеиновых кислот представляют собой высокоспецифичный инструмент модуляции экспрессии генов. Подавление ряда генов, аномально высокая экспрессия которых возникает при неопластической трансформации, можно осуществить с помощью препаратов на основе нуклеиновых кислот, таких как антисмысловые олигонуклеотиды (asON). В общем, механизм подавления экспрессии генов заключается в их комплементарном связывании с мРНК-мишенью, после чего целевая мРНК либо подвергается расщеплению, либо блокируется процесс ее трансляции.
asON представляют собой синтетические одноцепочные ДНК длиной 15-20 нуклеотидов. В последнее время были получены asON, способные препятствовать транспорту сплайсированной мРНК из ядра в цитоплазму, а также asON, которые в результате блокирования сайта сплайсинга в пре-мРНК способны приводить к экспрессии альтернативного варианта белка.
Ввиду того, что природные олигодезоксирибонуклеотиды в культуре клеток и в условиях in vivo подвергаются быстрой деградации под действием нуклеаз, для повышения их стабильности в структуру asON вводят различные химические модификации.
Химический синтез олигонуклеотидов
Твердофазный синтез широко используется в синтезе пептидов, синтезе олигонуклеотидов, синтезе олигосахаридов и комбинаторной химии. Твердофазный химический синтез был изобретен в 1960-е годы Брюсом Меррифилдом, и был удостоен Нобелевской премии по химии в 1984 году.
Твердофазный синтез осуществляют на твердом носителе, между фильтрами, в столбцах, которые пропускают все реагенты и растворители. Твердофазный синтез имеет ряд преимуществ по сравнению с синтезом в растворе:
обеспечивает высокую скорость реакции
примеси и избыток реагентов смываются, поэтому очистка после каждого шага не требуется
процесс поддается автоматизации на твердофазных синтезаторах с компьютерным управлением.
Твердые носители (называемые также смолами) представляют из себя нерастворимые в воде частицы, как правило, 50-200 мкм в диаметре, к которым олигонуклеотид присоединяется в процессе синтеза.
Имеются данные, что одним из наиболее эффективных материалов, которые можно использовать в качестве твердого носителя, является пористое стекло. Оно достаточно жесткое и не способно к набуханю. В его глубоких порах, происходит синтез олигонуклеотидов. Стекло содержит 500 Å (50 нм) поры, которые подходят для синтеза коротких олигонуклеотидов. Тем не менее, оно плохо подходит для синтеза олигонуклеотидов более 40 оснований в длину. Это связано с тем, что растущий олигонуклеотид блокирует поры и уменьшает диффузию реагентов через матрицу.
Твердые носители для обычного синтеза олигонуклеотидов, как правило, изготовлены с нагрузкой 20-30 мкмоль нуклеозида на грамм смолы. Синтез олигонуклеотидов при более высоких нагрузках становится менее эффективным вследствие стерических затруднений между соседними цепями ДНК, присоединенных к смоле.
Этапы химического синтеза олигонуклеотидов
Фосфорамидатный олиго-синтез протекает в 3′- к 5′-направлении (противоположном 5′- к 3′-направлении биосинтеза ДНК в репликации ДНК). Один нуклеотид добавляется за синтез цикла.
Рис. 2. Фосфорамидатный олигонуклеотидный цикл синтеза
В начале олигонуклеотидного синтеза первый нуклеозид предварительно присоединяют к смоле (носителю), и выбираются колонны синтеза A, G, C или T в зависимости от нуклеозида на 3′-конце желаемого олигонуклеотида. Закрепленный нуклеозид имеет 5′-ДMT защитную группу (ДМТ = 4,4′-диметокситритил), роль которой состоит в предотвращении полимеризации, и эта защитная группа должна быть удалена (детритилирование). Механизм детрилирования показан на рисунке 3.
Рис.3. Механизм удаления защитной группы.
После детритилирования, закрепленный нуклеозид готов реагировать со следующим основанием, который добавляется в виде нуклеозид-фосфорамидатного мономера. Большой избыток соответствующего нуклеозида, смешивают с активатором (тетразолом или его производными). Диизопропиламиногруппа нуклеозида протонируется активатором, и, таким образом, превращается в хорошо отсоединяющуюся группу. Она быстро вытесняется 5′-гидроксильной группой связанного нуклеозида, создавая фосфит триэфир (рис. 4).
Рис.4. Механизм протонирования активатором.
Нуклеозидные фосфорамидиты достаточно стабильны в инертной атмосфере, и могут быть получены в больших количествах, доставляться по всему миру, и храниться в виде сухого твердого вещества в течение нескольких месяцев перед использованием.
Однако даже при высокоточных работах по синтезу олигонуклеотидов, остается вероятность, что там будет несколько непрореагировавших 5′-гидроксильных групп, которые будут доступны для участия в следующей стадии. Если подобное нарушение не остановить, они будут накапливаться с каждым последующим циклом, и конечный продукт будет сложной смесью олигонуклеотидов, большинство из которых будет нести неправильную генетическую информацию.
Поэтому метод ацетилирования 5′-гидроксильных групп делает их инертным по отношению к последующей реакции. Это необходимо также и для минимизации примесей.
Фосфит-триэфир (Р (III)), образованный на стадии присоединения неустойчив к кислотам и должен быть преобразован в стабильную форму (P (V)). Это достигается за счет окисления йода в присутствии воды и пиридина (рис. 5). Полученный фосфотриэфир фактически представляет собой ДНК ось, защищенную 2-цианоэтил группой. Группа цианоэтила предотвращает нежелательные реакции с фосфором во время последующих циклов синтеза.
Рис.5. Механизм окислительной стадии.
После этого, ДМТ-защитная группа на 5′-конце цепи ДНК должна быть удалена так, чтобы первичная гидроксильная группа могла вступить в реакцию со следующим нуклеотид-фосфорамидатом. Реакция удаления защитной группы с помощью трихлоруксусной кислоты в дихлорметане протекает быстро. Цикл повторяется, один раз для каждой основы, до получения требуемого олигонуклеотида.
Далее необходимо отсоединить синтезированный олигонуклеотид от твердого носителя. В этом случае используется сукцинил. Разделение возможно при обработке концентрированным водным раствором аммиака при комнатной температуре в течение одного часа (рис. 6).
Рис.6. Механизм отделения олигонуклеотида от твердого носителя в концентрированном водном растворе аммиака.
Реакция расщепления осуществляется автоматически на некоторых синтезаторах, и аммиачный раствор, содержащий олигонуклеотид, поступает в стеклянный флакон. В качестве альтернативы, расщепление может быть осуществлено вручную путем принятия колонки от синтезатора и промыванием в шприцах, содержащих гидроксид аммония.
Олигонуклеотид растворяется в концентрированном водном растворе аммиака, а последующий нагрев позволяет удалить защитные группы из гетероциклических оснований и фосфатов. Водный раствор затем удаляют выпариванием и олигонуклеотид готов к очистке.
Кроме ДМТ-защитной группы, необходимы также дополнительные защитные группы и для аденина, цитозина и гуанина (рис.7). Однако для тимина в этом нет необходимости.
Рис.7. Структуры защитных групп, обычно используемые для защиты адениновых, цитозиновых и гуаниновых оснований во время фосфорамидатного синтеза ДНК олигонуклеотидов.
Выводы
1. Искусственно синтезированные олигонуклеотиды находят все более широкое применение в различных областях науки, а методы их получения все более совершенствуются, что позволяет синтезировать достаточное количество олигонуклеотидов для лабораторных экспериментов и для создания терапевтических препаратов.
2. На сегодняшний день, самым распространенным методом синтеза олигонуклеотидов остается метод твердофазного синтеза, который позволяет существенно ускорять процесс получения олигонуклеотидов, а также уменьшать объемы затраченных реактивов.
Перспективным направлением является развитие генных технологий.
1. Они способны существенно оптимизировать традиционную фармакотерапию (фармакогеномика).
2. Особые надежды возлагаются на генно-инженерные разработки препаратов для защиты от инфекционных болезней и патогенов.
Еще одно направление - биотехнологические препараты. Начинается конкуренция между традиционными синтетическими лекарственными средствами и биофармацевтическими препаратами. Становится привычным новый термин «биофармация».
В 2006 году объем мирового фармарынка составлял примерно 640 млрд. долл., при этом 10% уже приходилось на долю биотехнологических продуктов. Лидерами в области биофармации являются США и Германия.
Разработке современных биофармацевтических препаратов предшествовало освоение других биотехнологических методов, в частности ферментации бактерий и грибов, что позволило развить промышленное производство низкомолекулярных лекарственных средств, например антибиотиков, ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы (гидрокси-метилглутарил-коферментаА-редуктаза) и иммуносупрессоров. Биотехнологические лекарственные средства - это лекарственные препараты, предназначенные для профилактики, лечения или диагностики in vivo, которые развивают не фармакологическую, а биологическую активность. Они обладают рядом существенных отличий от химико-синтетических лекарственных средств. Действующее вещество биотехнологических препаратов имеет биологическое происхождение и является производным от живых клеток, обладает сложной гетерогенной молекулярной структурой. Исходным субстратом служат клетки животного происхождения или микроорганизмы (бактерии типа E.coli, дрожжи и пр.), используются их клеточные и субклеточные структуры.
Существенным отличием биотехнологических лекарственных средств является то, что в них используется естественная способность к метаболизму.
Для их получения производится изоляция и изменение геномной ДНК исходного продукта таким образом, что он получает новую, неспецифическую для данного вида способность к биосинтезу, которая и используется в лекарственных средствах. В первую очередь здесь следует назвать создание генномодифицированных организмов для получения рекомбинантных терапевтических протеинов. В настоящее время уже используется 115 лекарственных средств на основе 84 терапевтических протеинов. В 2006 г. в США в разработке находилось 418 биофармацевтических лекарственных средств, в Европе - 320. Часть из них уже проходят клинические исследования и скоро станут доступными врачам и их пациентам. По оптимистическим прогнозам, в 2015 г. половина инновационных лекарственных средств в мире будут основаны на протеинах или олигонуклеотидах. Следует также ожидать выхода на фармрынок новой категории лекарственных средств - биосимиляров - аналогов оригинальных биотехнологических лекарственных средств со сходной, но неидентичной активной молекулой. В ЕС в этом году зарегистрированы два первых биосимиляра (гормона роста - соматотропина). На регистрации в European Medicines Agency находятся порядка 12 биосимиляров (эритропоэтин и др.). Ожидается, что введение в медицинскую практику биосимиляров резко снизит затраты здравоохранения на биотехнологические лекарственные средства, сделает их доступными для широких слоев населения. В руках у врачей окажутся еще более эффективные препараты для борьбы с серьезными заболеваниями, многие из которых раньше считались неизлечимыми.
04.07.2013 - 31.12.2013
Проведен систематический анализ современной литературы по теме исследования. Установлены последовательности наиболее перспективных, с точки зрения исполнителей проекта, производных олигонуклеотидов и их аналогов, которые должны проявлять противовирусную и антибактериальную активности.
Разработаны методики синтеза модифицированных олигонуклеотидов и их конъюгатов с использованием автоматических ДНК/РНК-синтезаторов или в режиме неавтоматизированного синтеза на твердотельном носителе. Для дизайна олигонуклеотидных производных с заданной функциональностью предложены различные подходы, в том числе, основанные на прогностическом анализе структуры и стабильности формируемых дуплексов с помощью метода молекулярной динамики. Предложен способ синтеза новых, ранее не описанных производных олигонуклеотидов, несущих модификации по атому фосфора межнуклеотидной фосфодиэфирной группировки.
Разработана методика анализа эффективности проникновения флуоресцеин-меченных соединений в бактериальные клетки. Показано, что положительно заряженные производные пептида Flu-(LR)4G-амида эффективно проникают и накапливаются в Pseudomonas aeruginosa, а эффективность проникновения в нее олигонуклеотидов без транспортного пептида низка.
Все разработанные при выполнении исследований методики, как синтетические, так и аналитические, внедрены в работу Лаборатории Биомедицинской Химии ИХБФМ СО РАН. Полученные теоретические наработки использованы в образовательных курсах.
Созданная в лаборатории синтетическая база для получения, выделения и характеризации олигонуклеотидов является уникальной для РФ и близка к уровню лучших мировых научно-исследовательских лабораторий соответствующей специализации. Привлечение специалистов биологического профиля делает лабораторию уникальной по потенциалу ее научно-исследовательской реализации в направлении разработки РНК-направленных противовирусных и антибактериальных препаратов.
Развернуть
01.01.2014 - 31.12.2014
i) Оценка антибактериальной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Оценка антивирусной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к вируса гриппа WSN33/A/H1N1.
iii) Выбор последовательностей олигонуклеотидных аналогов- лидеров, проявляющих антибактериальную или противовирусную активность на требуемом уровне;
iv) Разработка протоколов синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих группы, которые увеличивают эффективность их накопления в эукариотических или бактериальных клетках
iv) Оценка эффективности проникновения и накопления разработанных соединений в бактериальных и эукариотических клетках.
v) Подготовленная лаборатория;
vi) Статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science.
vii) Тезисы докладов на конференциях;
viii) Свидетельства об участии в в образовательных курсах;
ix) Конференция;
Развернуть
01.01.2015 - 31.12.2015
3.1 Антибактериальная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (в клеточной культуре);
3.2 Противовирусная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры, по отношению к вирусу гриппа in vitro;
3.3. Технологические и терапевтические характеристики отобранных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов с учетом путей коммерциализации препаратов, в том числе:
3.3.1 Список стандартизованных экспериментальных методик для оценки антибактериальной и противовирусной активности препаратов олигонуклеотидных аналогов in vitro (в культуре клеток) и in vivo (на животных моделях);
3.3.3 Отобранные олигонуклеотидные аналоги и конъюгаты, которые наряду с проявлением высокой антибактериальной и противовирусной активности способны к эффективному проникновению и накоплению в клетках, в том числе:
3.3.2.1 Данные по проникновению в клетки и доставки модифицированных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов;
3.3.2.2 Оптимизированный полупрепаративный синтез, пре- и пост-синтетические модификации, выделение и количественный контроль олигонуклеотидных аналогов, проявляющих антибактериальную и противовирусную активность;
3.3.2.3. Оценка разработанных соединений с антибактериальной и противовирусной активностью с точки зрения коммерческого использования.
3.4 Подготовленный финальный отчет по Проекту;
3.5 Подготовленная лаборатория;
3.6 Тезисы докладов на конференциях;
3.7 Свидетельства об участии в в образовательных курсах;
3.8 3статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science
В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, который не синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработаны терапевтические
системы с использованием специфических олигонуклеотидов. Такой небольшой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонуклеотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «антигенным», а тот, который гибридизуется с соответствующей мРНК, - «антисмысловым» (Antisense RNA). Для предотвращения активации транскрипции специфических генов можно так-же использовать двухцепочечные олигонуклеотиды, специфично присоединяющиеся к ДНК-связывающим белкам (белкам-активаторам). Наконец, для уменьшения количества определенной мРНК и синтезируемого на ней белка можно использовать рибозимы - природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими молекулами РНК и разрезают их.
В будущем лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главным объектом научных исследований и клинических испытаний будут различные «антисмысловые» олигонуклеотиды.
3.1..«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства
«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагается использовать в качестве лекарственного средства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).
Терапевтический эффект синтетических «антисмысловых» олигонуклео-тидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.
Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-углеродному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.
Проникновение «антисмыловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.
Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.
«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с помощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у пациентов с болезнью Крона. Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.
В принципе «антисмысловые» олигонуклеотиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств.
«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагается использовать в качестве лекарственного средства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).
Терапевтический эффект синтетических «антисмысловых» олигонуклео-тидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.
Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-углеродному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.
Проникновение «антисмыловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.
Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.
«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с помощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у пациентов с болезнью Крона. Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.
В принципе «антисмысловые» олигонуклеотиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств.